## 6.1 SUGAR-TARGET糖基转移酶级联反应：四轮复用验证平台架构

SUGAR-TARGET平台将四种固定化酶——GnTI、ManII、GalT和SiaT——依次排布于链霉亲和素包被的硅胶微珠上，构成时空分隔的串联反应区室[src_C05]。固定化采用生物素–链霉亲和素体系，借助体内生物素化（BirA/AviTag）实现一步固定与纯化，可直接从大肠杆菌裂解液中操作：GnTI和GalT的生物素化产率>65%，SiaT>85%[src_C05]。微珠上检测不到酶的渗漏——对于须满足宿主细胞蛋白（HCP）及ICH Q3D(R2)残留限量要求的原料药而言，这是一项关键质量属性[src_C05]。

GalT复用实验的操作稳定性数据是衡量平台性能的核心指标。固定化GalT累计运行超过80小时、历经四个循环后，仍保留初始活性的70%以上；CHO来源的人IgG（h-IgG）末端半乳糖基化率在第一轮后达到97.4%，第四轮后仍维持在84%[src_C05]。级联反应各步骤对目标糖型的转化率均>95%。活性下降源于洗涤步骤中少量酶的流失，而非酶的变性失活。

将该平台转化至GalNAc-siRNA生产时，底物由糖蛋白IgG替换为短链寡核苷酸（21聚体，约6–8 kDa）。寡核苷酸对酶活性位点的空间位阻小于完整IgG Fc结构域，转化率有望超过大分子底物所展示的95%[src_C05, src_C09]。辅因子需求（UDP-GalNAc、UDP-Gal）可通过成熟的核苷酸糖再生级联体系解决，该体系可与主反应并行循环运行[src_C09]。2025年的扩展研究采用SpyCatcher/SpyTag将Leloir糖基转移酶固定于马来酰亚胺活化琼脂糖上，五种糖基转移酶（GT）变体的固定化产率为67%–100%，可在连续三天内完成六轮反应复用，比活性范围为285 mU·mg⁻¹（SpyC-β4GalT）至4,734 mU·mg⁻¹（SpyC-GTA/R176G）；部分变体在一个月后活性不降反升（SpyC-β4GalT达第1天的138%），原因在于载体赋予的构象稳定效应[src_G01]。

载体材料的选择对放大生产至关重要。SUGAR-TARGET在游离聚糖反应中使用硅胶微珠（机械强度高，可耐受中等背压），在蛋白质底物反应中使用磁性颗粒（磁性倾析取代离心，操作更便捷）[src_C05]。填充床反应器构型中，甲基丙烯酸酯共聚物微珠是优于琼脂糖的替代选择——琼脂糖在背压下易压缩变形，而前者刚性好，每克干载体蛋白载量可达20–80 mg，共价偶联后活性保留率为60%–85%[src_C08]。
