## 6.2 深共熔溶剂中的交联酶聚集体脂肪酶：单步去对称化消除保护基化学

用于siRNA偶联的2-乙酰氨基-2-脱氧-D-半乳糖（GalNAc）衍生物的化学合成，每条臂需要3至5步保护基操作，在4至6步序列中累计总收率≤41%[src_C10]。在深共熔溶剂（Deep Eutectic Solvent，DES）中采用交联酶聚集体（Cross-Linked Enzyme Aggregates，CLEA）脂肪酶去对称化，可将上述步骤压缩为一至两步酶促反应；据报道，N-乙酰己糖胺二乙酸酯底物的对映体过量值（ee）根据DES组成和底物浓度不同，可达93%至>99%[src_C09]。与化学路线相比，该方法通过消除乙酸酐（Ac₂O）、三氟甲磺酸（TfOH）及脱保护碱的化学计量用量，原子经济性提升40%至60%[src_C10]。

CLEA-LentiKats制剂（Guajardo等，*J Biotechnol* 2020）的制备分两步：先通过戊二醛交联将南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B）制成CLEA，再将聚集体包埋于LentiKats聚乙烯醇（PVA）水凝胶颗粒中[src_C10]。加入20%（v/v）水性缓冲液作为共溶剂，可在维持酶稳定性的同时将DES黏度降低至适合泵驱动连续流的水平。该制剂在未经优化的条件下已实现≥6个操作循环，每升累计产出10 g产物——由于DES中可达到更高的底物浓度（操作窗口为50 mM至1 M，而依赖辅因子的糖基转移酶仅为0.1至10 mM），其时空产率比等效溶液相反应高3至4倍[src_C10]。

CLEA-LK脂肪酶对流动反应器的适配性较高。LentiKats扁豆形微珠（直径约1至2 mm）填充床中的停留时间分布近似活塞流，可将停留时间精确控制在ee最大值对应的点，从而避免搅拌釜式反应器中因过度反应导致的外消旋化而使ee下降。载体兼容性仅限于不溶于DES且机械强度高的材料：LentiKats（交联PVA）和环氧甲基丙烯酸酯共聚物微珠符合要求，标准硅胶和琼脂糖则不适用[src_C08, src_C10]。DES工艺在法规层面面临的挑战在于溶剂表征：氯化胆碱/尿素（reline）和氯化胆碱/甘油均未被ICH Q3C分类，任何IND申报包均需进行自定义的每日可接受摄入量计算。