## 7.1 双靶点siRNA批次放行所需的强制性质控酶试剂盒

批次放行遵循类似USP <1239>寡核苷酸身份测试的工作流程：完整质量液相色谱-质谱/飞行时间质谱（LC-MS/TOF）确认、核苷组成分析、自下而上序列图谱分析、双链体验证及杂质谱分析。每个步骤至少需要一种高特异性生物催化剂。

**核苷组成分析（nucleoside composition analysis）** 的标准酶组合为：核酸酶P1（来源于*Penicillium citrinum*，具有广谱3'→5'单链RNA/DNA活性，释放5'-单磷酸核苷）、蛇毒磷酸二酯酶I（SVPD，3'→5'外切核酸酶，负责完成二核苷酸消化），以及碱性磷酸酶（小牛肠碱性磷酸酶或rSAP，去磷酸化后生成游离核苷，供反相液相色谱-质谱检测）[src_C14]。去磷酸化须在37°C下30分钟内转化率>99%；一旦不完全，79.97 Da的磷酸基团质量偏移将产生重叠电荷态，核苷定量比例随之失效 [src_D07]。

**自下而上序列图谱分析**采用核糖核酸酶T1（来源于*Aspergillus oryzae*，11 kDa），该酶在单链RNA中鸟苷3'端切割（特异性标记为Gp↓N），每条21聚体GalNAc-siRNA链可生成3至6个可唯一比对的片段 [src_C14]。辅以核糖核酸酶A（RNase A）消化（Cp↓N / Up↓N），提供重叠覆盖以完成全序列验证。对于双靶点构建体，基因A和基因B的正义链与反义链均须独立进行图谱分析，与单靶点药物相比，每批次酶用量翻倍。

**单独使用核酸酶P1** 已成为高度修饰siRNA的首选单酶方案。Jones等人2023年发表于《分析化学》（Analytical Chemistry，doi:10.1021/acs.analchem.2c04902）的研究表明，部分核酸酶P1消化可提供稳健的5'端和3'端覆盖及重叠片段，且不受2'-氟化状态、硫代磷酸酯含量或2'-OMe取代程度影响——其表现优于核糖核酸酶T1，后者的Gp↓N切割活性因2'-修饰鸟苷而部分减弱 [src_H01]。

**无RNase的DNase I** 在工作流程中有两处应用：（1）拼接RNA连接中的在制品DNA夹板去除——兆维的sgRNA/siRNA工艺明确在色谱纯化前用DNase I消化DNA夹板；（2）DNA模板或基因组残留的质控检测 [src_B16]。关键规格要求RNase交叉活性<0.01%；即使微量污染也会降解RNA分析物并使序列图谱分析失效 [src_D07]。

**多核苷酸激酶（T4）** 在连接位点引入T4 RNA连接酶1和2所需的5'-磷酸基团 [src_E42]。对于由约7聚体片段组装的批次，每条21聚体链需进行三次T4 PNK反应（每个双链体共六次），使其成为连接批次的化学计量量在制品酶；同时，它也是短链杂质32P末端标记检测的关键质控试剂 [src_B16]。

| 酶 | 特异性 | 主要检测用途 | 双靶点影响 | GMP供应商数量 |
|---|---|---|---|---|
| 核酸酶P1 | 广谱单链RNA/DNA 3'→5' | 核苷图谱；自下而上序列分析 | 每对链用量翻倍 | 3–4 |
| 核糖核酸酶T1 | Gp↓N（单链RNA） | 自下而上图谱分析 | 两对链均须图谱分析 | 3–4 |
| 核糖核酸酶A | Cp↓N / Up↓N（单链RNA） | 重叠覆盖 | 标准 | 2–3 |
| SVPD（PDE I） | 3'→5'外切核酸酶 | 核苷消化完成 | 标准 | 2–3 |
| 小牛肠碱性磷酸酶 / rSAP | 5'-磷酸水解 | 质谱前去磷酸化 | 必需 | 4–6 |
| DNase I（无RNase） | 双链DNA/单链DNA | 夹板去除；DNA纯度质控 | 连接批次强制要求 | 4–6 |
| T4 PNK | 5'-OH → 5'-P | 连接底物制备；32P杂质检测 | 连接批次强制要求 | 3–5 |