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4.4 无细胞体外转录与无模板酶法合成——前景与现实
关于GreenLight Biosciences，有必要作出更正。 该公司并未破产。GreenLight Biosciences Holdings, PBC于2023年7月24日完成私有化，由Fall Line Endurance Fund主导，交易金额为4550万美元 [src_E44]。私有化后的存续实体已全面转型至农业RNA领域，相继推出Calantha™（2023年获EPA注册的RNA杀虫剂）和Norroa（RNA防治瓦螨产品，2025年10月），并于2025年3月获得Just Climate领投的2500万美元C轮融资，专项用于农业商业化。该公司目前未披露任何治疗性siRNA生产活动。此前所称的每克不足1美元的生产成本，仅适用于农业用途的未修饰双链RNA（dsRNA），不能作为2'-F/2'-OMe修饰治疗性siRNA的成本基准，不应被如此引用。
体外转录（IVT）的根本瓶颈。 基于T7 RNA聚合酶的IVT只能生产未修饰或极少修饰的RNA。治疗性siRNA几乎在每个位置都需要交替引入2'-F和2'-OMe修饰，以抵抗体内核酸酶降解。T7 RNAP虽能以较低速率掺入2'-F-UTP和2'-F-CTP，但完全交替的2'-F/2'-OMe修饰模式合成尚未在GMP规模下得到验证。《Biotechnology Advances》2025年综述明确指出，IVT适用于未修饰dsRNA（农业、疫苗领域），但不适用于GMP规模的2'-修饰治疗性siRNA [src_B06]。
末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）无模板合成。 针对TdT的工程化改造以实现从头RNA合成的研究仍在持续推进。《Cell Reports Methods》2025年发表的TdT变体研究展示了渐进式改进：工程化鼠源TdT对2'-OMe-ATP的kcat/Km达到47.49 mM⁻¹min⁻¹，优于早期变体的19.51，但2'-OMe-UTP的掺入效率（kcat/Km = 2.66）仍是严重的限速步骤 [src_B10]。Codexis在TIDES EU 2023会议上展示的数据表明，经多轮迭代进化，TdT对2'-修饰RNA合成的效率持续提升 [src_E45]，技术进步有据可查，但距GMP就绪状态仍有差距。就DNA合成而言，TdT平台已可达600至750 nt；对于治疗级质量的完全交替2'-F/2'-OMe修饰21聚体RNA合成，实现这一目标的现实时间线为3至5年。
2'-缩醛乙酰丙酸酯（ALE）亚磷酰胺平台（化学改进，非酶法）。 ALE体系是固相合成化学层面的改进，并非酶促方法。其意义在于证明：采用合适的2'-保护基，基于化学的固相亚磷酰胺合成（SPOS）可高效合成长达215 nt的RNA，每循环偶联效率超过99% [src_B05]。对于200 nt序列，将偶联效率从98%提升至99.4%，理论全长产物（FLP）收率可从1.8%提高至30.2%，提升幅度达17倍 [src_B05]。ALE拓展了SPOS在向导RNA和mRNA疫苗候选物合成中的实际应用范围，但并未解决SPOS在溶剂废弃物和资本密集度方面的固有制约。