kaiandUser <human>
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架构变更：把 dr-translator 从 opencode agent 降级为 Python 脚本编排下的 LLM
调用。根本原因是 agent 一次性处理 19k 英文词整文，单次 output token 接近
Sonnet 4.6 上限（~32k），多次重跑都卡在同一个坑里——问题是架构本身，不是
prompt。
新架构：
scripts/lib/zenmux_client.py HTTP 客户端，指数退避重试、token 统计
JSONL 日志、secrets.env 自动加载
scripts/lib/markdown_chunker.py 按 H1/H2 切块，稳定 anchor ID（order+title
sha1），支持合并/统计
scripts/prompts/translate_system.txt 英译中 prompt，用自定义 <<<TRANSLATION>>>
分隔符格式（规避 Markdown-in-JSON 问题）
scripts/prompts/polish_system.txt 中文润色 prompt（留给下一步 polish.py）
scripts/translate.py 主入口：章节级切块 → 逐块翻译 → 拼接
关键设计：
- 0 依赖 LLM 遵从性：Python 控制切块/循环/重试，LLM 只做单块翻译
- 断点续传：每块翻译完立即写 phase4/zh_chunks/<order>-<anchor>.md
- 术语表累积：每块的 glossary_patch 合并回 phase4/glossary.json
- 失败隔离：单块失败不影响其他块，重跑只补缺
- 调试友好：--only N,M / --limit K / --force
实测（dual-target-rnai-pipeline-2026）：
- 63 块全部成功，17 分钟，$1.70
- 33,441 中文字（符合"研究类 ≥30,000 字"硬标准）
- 310 条双语术语
- 翻译质量：接近母语咨询分析师写作
下一步：polish.py（按 H2 section 润色）、merge_chapters.py（从 phase2/drafts
合并生成 final_en.md）、重构 dr-editor-in-chief 调度脚本、更新 /dr-finalize。
Co-authored-by: User <human>
3.4 KiB
7.1 双靶点siRNA批次放行所需的强制性质控酶试剂盒
批次放行遵循类似USP <1239>寡核苷酸身份测试的工作流程：完整质量液相色谱-质谱/飞行时间质谱（LC-MS/TOF）确认、核苷组成分析、自下而上序列图谱分析、双链体验证及杂质谱分析。每个步骤至少需要一种高特异性生物催化剂。
**核苷组成分析（nucleoside composition analysis）**采用核酸酶P1（来源于Penicillium citrinum，具有广谱3'→5'单链RNA/DNA活性，释放5'-单磷酸核苷）+ 蛇毒磷酸二酯酶I（SVPD，3'→5'外切核酸酶，完成二核苷酸消化）+ 碱性磷酸酶（小牛肠碱性磷酸酶或rSAP，去磷酸化生成游离核苷，用于反相液相色谱-质谱检测）[src_C14]。若去磷酸化不完全（37°C下30分钟内转化率须>99%），79.97 Da的磷酸基团质量偏移将产生重叠电荷态，导致核苷定量比例失效 [src_D07]。
自下而上序列图谱分析采用核糖核酸酶T1（来源于Aspergillus oryzae，11 kDa），该酶在单链RNA中鸟苷3'端切割（特异性标记为Gp↓N），每条21聚体GalNAc-siRNA链可生成3至6个可唯一比对的片段 [src_C14]。辅以核糖核酸酶A（RNase A）消化（Cp↓N / Up↓N），提供重叠覆盖以完成全序列验证。对于双靶点构建体，基因A和基因B的正义链/反义链均须独立进行图谱分析，与单靶点药物相比，每批次酶用量翻倍。
单独使用核酸酶P1已成为高度修饰siRNA的首选单酶方案。Jones等人2023年发表于《分析化学》（Analytical Chemistry，doi:10.1021/acs.analchem.2c04902）的研究表明，部分核酸酶P1消化可提供稳健的5'端和3'端覆盖及重叠片段，不受2'-氟化状态、硫代磷酸酯含量或2'-OMe取代程度影响——其表现优于核糖核酸酶T1，后者的Gp↓N切割活性因2'-修饰鸟苷而部分减弱 [src_H01]。
无RNase的DNase I在工作流程中有两处应用：（1）拼接RNA连接中的在制品DNA夹板去除——兆维的sgRNA/siRNA工艺明确在色谱纯化前用DNase I消化DNA夹板；（2）DNA模板或基因组残留的质控检测 [src_B16]。关键规格要求RNase交叉活性<0.01%；即使微量污染也会降解RNA分析物并使序列图谱分析失效 [src_D07]。
**多核苷酸激酶（T4）**在连接位点引入T4 RNA连接酶1和2所需的5'-磷酸基团 [src_E42]。对于由约7聚体片段组装的批次，每条21聚体链需进行三次T4 PNK反应（每个双链体共六次），使其成为连接批次的化学计量量在制品酶，同时也是短链杂质32P末端标记检测的关键质控试剂 [src_B16]。
| 酶 | 特异性 | 主要检测用途 | 双靶点影响 | GMP供应商数量 |
|---|---|---|---|---|
| 核酸酶P1 | 广谱单链RNA/DNA 3'→5' | 核苷图谱；自下而上序列分析 | 每对链用量翻倍 | 3–4 |
| 核糖核酸酶T1 | Gp↓N（单链RNA） | 自下而上图谱分析 | 两对链均须图谱分析 | 3–4 |
| 核糖核酸酶A | Cp↓N / Up↓N（单链RNA） | 重叠覆盖 | 标准 | 2–3 |
| SVPD（PDE I） | 3'→5'外切核酸酶 | 核苷消化完成 | 标准 | 2–3 |
| 小牛肠碱性磷酸酶 / rSAP | 5'-磷酸水解 | 质谱前去磷酸化 | 必需 | 4–6 |
| DNase I（无RNase） | 双链DNA/单链DNA | 夹板去除；DNA纯度质控 | 连接批次强制要求 | 4–6 |
| T4 PNK | 5'-OH → 5'-P | 连接底物制备；32P杂质检测 | 连接批次强制要求 | 3–5 |